A. Pengertian Mikropropagasi
Mikropogasi merupakan perbanyakan dari galur tanaman yang terpilih melalui teknik kultur jaringan.
B. Macam-Macam Mikropropagasi
1) Produksi tanaman dari tunas-tunas aksilar
Produksi tanaman dengan merangsang terbentuknya tunas-tunas aksilar merupakan teknik mikropropagasi yang paling umum dilakukan. Ada 2 (dua) metode produksi tunas aksilar yang dilakukan yaitu: kultur pucuk (shoot culture atau shoot-tip culture) dan kultur mata tunas (satu mata tunas: single-node culture; lebih dari satu mata tunas: multiple-node culture). Kedua teknik kultur ini berdasarkan pada prinsip perangsangan terbentuknya atau munculnya tunas-tunas samping dengan cara mematahkan dominasi apikal dari meristem apikal.
2) Kultur pucuk (shoot culture atau shoot-tip culture)
Kultur Pucuk (Shoot culture) adalah teknik mikropropagasi yang dilakukan dengan cara mengkulturkan eksplan yang mengandung meristem pucuk (apikal dan lateral) dengan tujuan perangsangan dan perbanyakan tunas-tunas/cabang-cabang aksilar. Tunas-tunas aksilar tersebut selanjutnya diperbanyak melalui prosedur yang sama seperti eksplan awalnya dan selanjutnya diakarkan dan ditumbuhkan dalam kondisi invivo.
Istilah yang digunakan untuk teknik kultur pucuk ini tergantung dari eksplan yang digunakan. Jika eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk-pucuk apikal (panjang ± 20 mm) saja maka tekniknya disebut sebagai shoot-tip culture, namun bila eksplan yang digunakan adalah ujung pucuk apikal beserta bagian tunas lain dibawahnya disebut sebagai shoot culture. Besar kecilnya eksplan yang digunakan mempengaruhi keberhasilan kultur pucuk. Semakin kecil eksplan, semakin kecil kemungkinannya untuk terkontaminasi oleh mikroorganisme namun semakin kecil juga kemampuannya untuk beregenerasi dan memperbanyak diri. Sebaliknya, semakin besar eksplan yang digunakan maka semakin besar kemampuannya untuk beradaptasi dalam kondisi invitro, namun makin besar juga kemungkinannya untuk terkontaminasi, makin banyak kebutuhannya akan media dan makin besar wadah/botol kultur yang diperlukan. Oleh karena itu perlu diketahui ukuran eksplan yang sesuai untuk masing-masing varietas dan spesies tanaman.
Pertumbuhan pucuk, inisiasi dan perbanyakan tunas aksilar yang dihasilkan umumnya dirangsang dengan cara menambahkan hormon pertumbuhan (umumnya sitokinin) ke dalam media pertumbuhannya. Perlakuan ini dapat merangsang pertumbuhan tunas samping dan mematahkan dominasi apikal dari pucuk yang dikulturkan. Selain itu, dominasi apikal juga dapat dihilangkan dengan perlakuan-perlakuan lain misalnya pemangkasan daun-daun yang terdapat pada buku-buku tunas atau meletakkan eskpan dalam posisi horisontal. Tunas-tunas aksilar yang dihasilkan selanjutnya digunakan sebagai stek miniatur bagi proses perbanyakan berikutnya. Dengan teknik ini dan disertai dengan sub kultur dapat diperoleh banyak sekali plantet dari satu eksplan. Dengan membatasi jumlah sub kultur sampai maksimal 8–10 kali dapat diperoleh klon tanaman yang true-to-type. Teknik ini telah digunakan secara luas untuk perbanyakan tanaman termasuk tanaman hortikultura seperti pisang, asparagus, anggrek Cymbidium, dll.
3) Kultur mata tunas/single-node atau multiple-node culture (invitro layering)
Kultur mata tunas ini merupakan salah satu teknik invitro yang digunakan untuk perbanyakan tanaman dengan merangsang munculnya tunas-tunas aksilar dari mata tunas yang dikulturkan. Seperti halnya kultur pucuk, eksplan yang digunakan dalam kultur mata tunas dapat berasal dari tunas lateral, tunas samping atau bagian dari batang yang mengandung satu atau lebih mata tunas (mengandung satu atau lebih buku). Dikenal dua teknik kultur mata tunas yaitu eksplan yang mengandung mata tunas lebih dari satu ditanam secara horisontal di atas medium padat (teknik invitro layering) atau (2) tiap buku yang mengandung satu mata tunas dipotong-potong dan ditanam secara terpisah dalam tiap-tiap botol kultur.
Seperti halnya teknik kultur pucuk, pertumbuhan tunas-tunas aksilar juga berdasarkan pada prinsip pematahan dominasi apikal. Oleh karena itu, pertumbuhan tunas-tunas aksilar ini terjadi jika eksplan (mata tunas) ditanam pada media yang mengandung sitokinin dalam konsentrasi cukup tinggi sehingga sitokinin ini dapat menghentikan dominasi pucuk apikal dan menyebabkan berkembangnya tunas-tunas aksilar. Tunas aksilar yang terbentuk selanjutnya dipisah-pisahkan dan dapat langsung ditanam pada media pengakaran sehingga diperoleh tanaman baru yang sempurna atau digunakan kembali sebagai bahan tanam untuk perbanyakan selanjutnya. Tunas-tunas tersebut selanjutnya diakarkan, diaklimatisasi dan selanjutnya ditanam di lapangan. Teknik ini telah lama dan banyak dipergunakan untuk perbanyakan tanaman hortikultura seperti kentang, asparagus, melon, semangka, anggrek, dan banyak lagi lainnya.
4) Induksi pembentukan tunas dari meristem bunga
Meristem bunga dapat juga dirangsang untuk membentuk tunas-tunas vegetatif dalam kondisi invitro. Eksplan yang digunakan adalah inflorescence bunga yang belum matang (immature inflorescences) yaitu yang belum membentuk organ-organ kelamin jantan dan betinanya. Penggunaan infloresence yang telah dewasa akan menghasilkan pembentukan organ bunga bukan kuncup vegetatif. Beberapa contoh tanaman hortikultura yang diperbanyak dengan teknik ini adalah brokoli, kol bunga, krisan dan sugar beat.
5) Inisiasi langsung tunas adventif
Tunas adventif adalah tunas yang terbentuk dari eksplan pada bagian yang bukan merupakan tempat asal terbentuknya (bukan dari mata tunas atau buku). Tunas-tunas adventif ini dapat terbentuk langsung dari eksplan tanpa melalui proses terbentuknya kalus terlebih dahulu. Teknik ini merupakan salah satu teknik mikropropagasi yang juga banyak dilakukan dan dapat menghasilkan plantlet dalam jumlah jauh lebih banyak dari teknik terdahulu (pembentukan tunas aksilar). Proses pembentukan tunas adventif langsung dari jaringan eksplan seperti akar, pucuk dan bunga disebut organogenesis.
Terjadinya organogenesis dipacu oleh adanya komponen-komponen seperti medium, komponen endogen selama eksplan mulai dikulturkan, dan senyawa-senyawa yang terbawa selama inisiasi eskplan. Selain itu organogenesis dipacu juga oleh keberadaan zat pengatur tumbuh eksogen di dalam medium. Tunas dan akar terbentuk pada beberapa lapis sel tipis pada eksplan beberapa spesies oleh adanya perbedaan konsentrasi antara auksin dan sitokinin. Inisiasi akar dapat dipacu dengan penambahan NAA dan zeatin dan pembentukan tunas dipacu dengan penambahan sitokinin seperti zeatin atau benzylaminopurine tanpa penambahan auksin. Pada beberapa spesies organogenesis terbentuk pada lapisan epidermal selama kultur invitro, misalnya pada tanaman Begonia rex (Dodds dan Robert, 1983).
Menurut Torrey (1966 dalam Dodds dan Roberts, 1983) membuat hipotesis bahwa organogenesis dari kalus diinisiasi dengan pembentukan kluster sel-sel meristem (meristemoid) mampu merespon pada faktor-faktor dalam jaringan untuk memproduksi primordium. Inisiasi pembentukan akar, tunas dan embrioid juga dipengaruhi oleh faktor-faktor internal alamiah.
Beberapa faktor yang berpengaruh terhadap rhizogenesis termasuk auksin, karbohidrat, pencahayaan, dan fotoperiode. Pada beberapa kultur jaringan auksin memacu pembentukan akar, sedangkan adanya auksin eksogen dapat menghambatnya dan rhizogenesis dapat distimulasi oleh anti-auksin.
Keberhasilan pembentukan tunas adventif secara langsung ini sangat tergantung pada bagian tanaman yang digunakan sebagai eksplan serta sangat dipengaruhi oleh spesies atau varietas tanaman asal eskplan tersebut. Pada tanaman yang responsif, hampir semua bagian tanaman (daun, akar, batang, meristem, dll.) dapat dirangsang membentuk organ adventif, namun pada tanaman lainnya tunas adventif ini hanya dapat terbentuk pada bagian-bagian tanaman tertentu saja seperti umbi lapis, embryo atau kecambah.
Seperti halnya teknik mikropropagasi lainnya, tunas adventif secara langsung ini terbentuk melalui serangkaian tahap mulai inisiasi (Tahap 1). Setelah eksplan berada pada kondisi aseptis dan tunas mulai tumbuh, eksplan dapat langsung disubkulturkan ke media perbanyakan (atau media yang sama dengan inisiasi: tergantung varietas) untuk memperbanyak tunas-tunas adventif dari mata tunas adventif yang telah terbentuk pada tahap sebelumnya.
Tunas-tunas tersebut selanjutnya dipisahkan, diakarkan dan diaklimatisasi untuk memproduksi tanaman lengkap dan utuh yang dapat tumbuh dalam keadaan alamiah.
Teknik ini telah banyak digunakan secara komersial untuk perbanyakan tanaman-tanaman hortikultura khususnya tanaman-tanaman hias. Contoh tanaman hias yang diperbanyak dengan teknik ini adalah tanaman-tanaman keluarga Gesneriaceae, seperti Achimenes, Saitpaulia, Sinningia dan Streptocarpus. Pada tanaman-tanaman tersebut, tunas langsung terbentuk dari eksplan daun tanpa pembentukan kalus terlebih dahulu.
6) Somatic embryogenesis langsung
Embrio aseksual atau embrio somatik (somatic embryo) adalah embrio yang terbentuk bukan dari penyatuan sel-sel gamet jantan dan betina atau dengan kata lain embrio yang terbentuk dari jaringan vegetatif/somatik. Embrio ini dapat terbentuk dari jaringan tanaman yang dikulturkan tanpa melalui proses yang dikenal dengan nama somatic embryogenesis. Jika proses ini terbentuk langsung pada eksplan tanpa melalui proses pembentukan kalus terlebih dahulu, maka prosesnya disebut somatic embryogenesis langsung (direct somatic embryogenesis).
Beberapa jenis tanaman hortikultura (misalnya jeruk) dapat secara alamiah membentuk embryo aseksual ini. Dalam kondisi alamiah, embrio aseksual ini terdapat terutama pada tanaman-tanaman yang bisa menghasilkan lebih dari satu embryo pada bijinya misalnya pada jeruk, atau tanaman yang menghasilkan biji-biji vegetatif (apomixis) misalnya pada manggis. Selain itu, embrio aseksual ini dapat juga terbentuk dari jaringan-jaringan tanaman seperti ovule, jaringan nukleus (nucellar embryoni), jaringan integumun pada ovule (misalnya pada pepaya), jaringan pembungkus biji/mesocaps pada wortel. Tanaman-tanaman tersebut dapat juga membentuk embrio aseksual ini secara invitro.
Dalam kondisis invitro, embrio aseksual ini dapat terbentuk secara langsung dari eksplan-eskplan embrio (seksual/zygotic) dari golongan monokotil dan dikotil, dari kecambah muda (hipocotyl dan cotyledon), dan bagian eksplan juvenil lainnya. Embrio aseksual ini dapat digunakan sebagai salah satu cara perbanyakan tanaman secara invitro. Embrio yang telah terbentuk dapat dimultiplikasi, selanjutnya melalui beberapa proses perkembangan sampai masak dan dapat berkecambah membentuk tanaman utuh. Tanaman ini selanjutnya diaklimatisasi dan ditanam pada kondisi alamiahnya. Teknik ini digunakan untuk perbanyakan beberapa tanaman hortikultura terutama anggrek dimana embrio aseksual (berupa protocorm like body, plb) terbentuk dari dari meristem, daun, dll.
7) Pembentukan organ penyimpan cadangan makanan mikro
Beberapa jenis tanaman dapat dikembangbiakan secara vegetatif dengan menggunakan organ penyimpanan seperti tuber, rhizome, bulbus, dll. Organ-organ penyimpanan ini juga bisa dihasilkan pada tanaman-tanaman yang memang secara alamiah memproduksi organ penyimpanan tersebut. Teknik untuk mendapatkan organ penyimpanan ini sangat bervariasi tergantung pada jenis jaringan yang dikulturkan. Organ penyimpanan mikro ini dapat digunakan sebagai bibit untuk penanaman langsung di lapangan atau ditanam untuk produksi umbi-umbi bibit. Beberapa jenis organ penyimpanan mikro yang telah dikembangkan adalah pembentukan umbi lapis mikro (bulbil) pada amarylis dan lili paris, pembentukan corm mikro (cormlet) pada gladiol, pembentukan protocorm pada anggrek dan pembentukan tuber mikro (tuberlet) pada kentang.
Umbi lapis mikro (bulbil) dan corm mikro (cormlet)
Umbi lapis mikro (bulbil/bulblet) dan kormus mikro (cormlet) dapat dirangsang untuk terbentuk secara invitro pada spesies-spesies tanaman yang secara alamiah dapat membentuk bulbus dan corm. Bulbil dapat terbentuk langsung pada kuncup/tunas aksilar dan dapat pula terbentuk pada tunas adventif yang terbentuk dari eksplan daun, ovary, inflorescence, dan diantara lapisan-lapisan daun bulbus.
Dominasi tunas-tunas apikal seringkali menghambat terbentuknya tunas-tunas adventif pada potongan eksplan bulbus. Subkultur potongan bulbus tersebut dapat merangsang terbentuknya bulbil atau terbentuknya tunas-tunas adventif dimana bulbil nantinya dapat terbentuk. Propagul yang dihasilkan dan diaklimatisasi dapat berupa plantlet, plantlet yang mengandung bulbil atau dorman bulbil. Contoh tanaman yang menghaslkan bulblet adalah lili, dan bawang-bawangan.
Beberapa jenis tanaman monokotil lainnya dapat memproduksi organ penyimpanan mikro pada dasar batangnya (corm), seperti pada gladiol. Cormlet pada gladiol dapat terbentuk langsung pada jaringan eksplan, pada kalus, atau pada plantlet yang telah berakar namun masih dalam botol kultur setelah daun-daunnya mengalami senescence. Cormlet yang dihasilkan secara invitro ini dapat digunakan langsung sebagai bibit di lapangan atau digunakan sebagai eksplan untuk kultur berikutnya.
Tuber mikro (tuberlet) pada kentang
Tanaman-tanaman yang secara alamiah dapat memproduksi tuber dapat juga memproduksi tuber mikro (tuberlet) secara invitro dalam lingkungan kultur yang sesuai. Dalam kultur invitro tuberlet ini dapat terbentuk langsung pada batang plantlet dan tuber muncul pada tunas-tunas aksilar sepanjang tunasnya. Tuber ini biasanya terbentuk pada batang plantlet yang ditanam dalam media yang mengandung sitokinin pada konsentrasi tinggi. Tuber ini biasanya lebih mudah terbentuk pada kondisi gelap dibandingkan dengan penanamannya dalam kondisi terang. Tuber mikro yang dihasilkan secara invitro ini dapat langsung digunakan sebagai bibit di lapangan dan dapat memproduksi tanaman kentang yang normal. Selain itu, tuberlet ini juga dapat digunakan sebagai bahan tanam dasar untuk produksi umbi bibit kentang berkualitas.
Pembentukan Tuber Kentang Mikro yang Diperoleh dari Kultur Pucuk Umur 10 minggu Setelah Inisiasi, skala bar = 10 mm (Sumber: Trigiano & Gray, 2000)
C. Teknik Mikropropagasi
Propagasi klonal in vitro dikenal dengan istilah mikropropagasi. Kata klon digunakan pertama kali oleh Webber untuk tanaman budidaya yang dihasilkan dari propagasi vegetatif. Jadi propagasi klonal adalah multiplikasi dari individu gen identik melalui reproduksi aseksual sedangkan klon itu sendiri adalah satu populasi tanaman derivat (turunan) dari satu individu tunggal yang dihasilkan melalui reproduksi aseksual.
Seiring dengan perkembangan pemahaman dan kemajuan kultur jaringan maka dewasa ini teknik-teknik kultur jaringan telah digunakan untuk berbagai tujuan termasuk industri bibit tanaman. Teknik perbanyakan mikro (mikropropagasi) telah lama digunakan dan merupakan salah satu contoh menarik dan klasik dari penerapan teknik kultur jaringan. Teknik ini dilakukan dengan cara menanam eksplan berupa pucuk beserta jaringan meristemnya yang dikenal sebagai teknik kultur pucuk (Shoot tip culture) atau menanam tunas lateral dengan satu atau lebih buku (single node and multiple node culture). Teknik terakhir juga dikenal dengan istilah in-vitro layering.
Perbanyakan mikro secara umum dapat diartikan sebagai usaha menumbuhkan bagian tanaman dalam media aseptis kemudian memperbanyak bagian tanaman tersebut sehingga dihasilkan tanaman sempurna dalam jumlah banyak. Tujuan utamanya adalah memproduksi tanaman dalam jumlah besar dan waktu yang singkat.
Teknik ini juga dikenal dengan upaya clonning untuk memproduksi klon tanaman dari jaringan vegetatif. Oleh karena itu tanaman yang dihasilkan melalui upaya clonning ini adalah identik atau serupa dengan induknya.
D. Manfaat Teknik Mikropropagasi.
Teknik perbanyakan in-vitro ini dilakukan dalam industri bibit karena teknik ini memiliki manfaat , antara lain:
- Dapat digunakan untuk memproduksi bibit dalam jumlah banyak dan waktu yang relatif singkat. Salah satu keunggulan mikropropagasi adalah perbanyakan organ tanaman yang dihasilkannya. Penggunaan hormon pertumbuhan sintetis memungkinkan perbanyakan eksplan dalam jumlah banyak dan waktu singkat. Perbanyakan di dalam wadah kecil memungkinkan dilakukan perbanyakan cepat ini. Dewasa ini telah dilakukan automatisasi dalam mikropropagasi menggunakan mesin pembuat media dan sterilisasi media, pemotongan dan sterilisasi ekspan yang dikendalikan dengan komputer sehingga dapat dilakukan perbanyakan secara lebih cepat dan lebih efisien.
- Dapat menghasilkan bibit dengan ukuran seragam. Produksi klon secara in vitro dapat dikontrol lebih mudah dbandingkan produksinya dilapangan karena perbanyakan dilakukan dalam wadah kecil. Oleh karena itu bisa dihasilkan klon dengan ukuran yang seragam dalam saat yang bersamaan. Penanaman bibit yang seragam mempermudah pemeliharaan tanaman di lapangan dan panen dapat dilakukan secara serempak.
- Tidak membutuhkan eksplan dalam jumlah banyak sehingga menghindari kerusakan tanaman induk. Sebaliknya stek, cangkok, penyambungan/penempelan yang intensif dari satu pohon induk dapat mengganggu pertumbuhan tanaman induk bahkan dapat merusaknya.
- Dapat digunakan untuk perbanyakan cepat tanaman langka, tanaman dengan nilai ekonomis tinggi, atau varietas unggul hasil pemuliaan tanaman.
- Dapat digunakan untuk memproduksi dan memperbanyak tanaman yang bebas virus melalui teknik kultur meristem.
Penyakit virus menyebabkan banyak kerugian dan kehilangan produksi tanaman pertanian. Seringkali infeksi virus tidak menyebabkan gejala awal yang dapat dilihat, namun akan nampak mengurangi vigor atau penampilan tanaman dan menurunkan kualitas maupun kuantitas hasil. Dewasa ini belum ada cara pengendalian dan pemberantasannya yang efektif. Hal ini menjadi masalah bagi tanaman hortikultura yang diperbanyak secara vegetatif misalnya kentang dan jeruk karena virus akan terbawa oleh keturunanannya. Isolasi dan penaman jaringan yang bebas virus (meristem) secara in vitro telah berhasil memproduksi klon kentang dan jeruk bebas virus.
Selain manfaatnya tersebut, perbanyakan dengan teknik kultur jaringan ini juga memiliki kelemahan antara lain agar usaha ini berhasil diperlukan ketrampilan khusus, fasilitas pendukung produksi yang khusus, mungkin diperlukan metode-metode khusus untuk mengoptimalkan produksi masing-masing varietas tanaman dan spesies dan karena metode yang dewasa ini tersedia membutuhkan banyak tenaga kerja maka biaya produksinya umumnya tinggi.
Selain hal tersebut dapat terjadi variasi tanaman yang dihasilkan dari perbanyakan secara in-vitro sehingga tanaman yang dihasilkan berbeda dengan induknya. Variasi ini dikenal dengan istilah “variasi somaklonal” karena variasi muncul pada klon yang dihasilkan dari organ-organ somatik (vegetatif). Hal ini dapat terjadi karena tanaman terus menerus dan dalam waktu lama ditanam dan diperbanyak dalam media yang mengandung hormon pertumbuhan tertentu.
Variasi ini juga timbul bilamana eksplan ditanam dalam media yang memungkinkan terbentuknya kalus. Pembelahan sel yang sangat cepat pada kalus dapat mengakibatkan perubahan genetis sel-sel kalus akibat penyimpangan informasi genetis yang diterima oleh masing-masing sel kalus tersebut.
Variasi somaklonal ini dapat dikurangi dengan cara :
- Membatasi jumlah sub-kultur dan perbanyaknnya,
- Menanam dalam medium tanpa hormon pertumbuhan untuk satu atau dua periode sub kultur dan
- Jika memungkinkan menghindari perbanyakan melalui kultur kalus. Namun pada beberapa jenis tanaman, terutama tanaman yang tidak bisa diperbanyak dengan stek dan sulit dirangsang pembentukan tunas-tunas adventifnya maka kultur kalus yang diregenerasikan melalui organogenesis dan embryogenesis merupakan alternatif perbanyakan yang memungkinkan. Apabila variasi somaklonal tidak dapat dihindari, perlu dilakukan pengujian sifat-sifat tanaman yang diregenerasikan sebelum klon dijual secara komersial.
Manfaat Mikropropagasi Dalam Pemuliaan Tanaman
Teknik mikropropagasi dalam pemuliaan tanaman pada umumnya digunakan antara lain:
- Untuk menghasilkan tanaman bebas penyakit (nematoda, mycoplasma, viroid, virus, jamur dll.).
- Menghasilkan kultivar baru atau tanaman superior, hybrid baru, seleksi dan klon local, genotip elit.
- Menghasilkan galur tetua jantan steril.
- Menghasilkan induksi mutan secara spontan
- Membuat variasi genetik.
